Question

【題目】下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖中甲、乙中標注了相關限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的不再重復標注。請回答下列問題。

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	Sau3AⅠ	HindⅢ
識別序 列及切割 位點	G↓GATCC CCTAG↑G	T↓GATCA ACTAG↑T	↓GATC CTAG↑	A↓AGCTT TTCGA↑A

(1)用圖中質粒和目的基因構建重組質粒，應選用限制酶為______，酶切后的載體和目的基因片段通過________酶作用后，獲得重組質粒。

(2)若BclⅠ酶切的DNA末端與HindⅢ酶切的DNA末端可直接被DNA連接酶連接，原因是_______，這兩種酶_____________(填“都能” “都不能”或“只有一種能”)切開連接的部位，原因是________________________。

(3)若用Sau3AⅠ切割圖甲質粒最多可能獲得______種大小不同的DNA片段。
(4)為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養基中添加________平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖乙中的____________________________________。

Answer 1

【答案】BclⅠ和HindⅢ DNA連接 黏性末端相同 都不能 核苷酸序列不能再被BclⅠ和HindⅢ識別切割 7 四環素 引物A和引物C

【解析】

1、選擇限制酶需注意插入目的基因時不能破壞標記基因。PCR擴增基因時，兩種引物結合的部位相反，延伸的方向相反。限制酶具有特異性，不同的限制酶識別不同的序列，判斷某種限制酶能否切割該片段，應該看該片段中是否含有限制酶的識別序列。

2、根據題意和圖示分析可知：在質粒上存在BamH I、BclⅠ、 BamH I和HindⅢ等四個酶切位點，其中BamHI的切割位點在兩個抗性基因上都有，Ⅰ而抗性基因為載體的標記基因，因此不可用該酶切割。在目的基因上，BclⅠ、BamH I、HindⅢ和 Sau3A I四種酶也存在酶切位點。

(1)若選BamHⅠ和HindⅢ切割，則會破壞質粒中的兩個抗性基因，不利于后期的篩選。選擇的限制酶應在目的基因兩側切割，切割后的DNA片段用DNA連接酶連接。

(2)BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端可直接被DNA連接酶連接，原因是黏性末端相同，但是被DNA連接酶連接后便不能再被這兩種限制酶切割了，因為不滿足兩種限制酶對其所識別序列的特異性要求。

(3)Sau3AⅠ在圖甲質粒中一共有3個切點，考慮完全酶切和不完全酶切，最多可能得到7種不同大小的DNA片段。

(4)為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養基中添加四環素(根據標記基因的種類)，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物應具有成對反向的特點。