Question

【題目】口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種動物傳染病，目前常用接種弱毒疫苗的方法預防。疫苗的主要成分是該病毒的一種結構蛋白VP1�？茖W家嘗試利用轉基因番茄來生產口蹄疫疫苗。請回答下列問題。

（1）上圖是VP1基因、農桿菌Ti質粒結構示意圖，若用以構建具有VP1基因的基因表達載體，還需要在質粒中插入__________________。

（2）口蹄疫病毒的遺傳物質為RNA，則獲得可重組到質粒的VP1基因必須用到____________酶。要獲得大量VP1基因，可利用__________技術進行擴增。

（3）通常用BamHⅠ、HindⅢ兩種限制酶切割VP1基因和Ti質粒的目的是____________________。要篩選出含有該目的基因表達載體的農桿菌，首先需要在含________________的培養基上進行。

（4）VP1基因應插入到農桿菌Ti質粒的T-DNA上，通過轉化作用進入番茄細胞并插入到______________，使VP1基因能夠穩定存在并發揮作用。

（5）獲得表達VP1蛋白的番茄植株以后，要進行免疫效力的測定，具體方法是將從轉基因番茄葉片中提取的VP1蛋白質注射到一定數量的豚鼠體內，每半個月注射一次，三次注射后檢測豚鼠血液中產生的___________________數量，為了使結果可信，應設置空白對照組。

Answer 1

【答案】啟動子 逆轉錄 PCR 防止VP1基因、Ti質粒的自身環化和反向連接 卡那霉素 染色體DNA VP1蛋白的抗體

【解析】

基因表達載體的構建過程中，目的基因、啟動子、終止子和標記基因不可缺少，其中標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來，據題意可知，目的基因是VP1基因。

（1）上圖是VP1基因、農桿菌Ti質粒結構示意圖，已經具備復制原點、終止子、標記基因、目的基因等，因此還需要在質粒中插入啟動子。

（2）口蹄疫病毒的遺傳物質為RNA，因此要獲得可重組到質粒的VP1基因，必須先逆轉錄生成相應的DNA，需用到逆轉錄酶。要獲得大量VP1基因，可利用PCR技術進行擴增。

（3）如果只用同一種限制酶切割，產生的黏性末端相同，會出現目的基因、運載體自身環化，或者目的基因和運載體反向連接，因此用BamHⅠ、HindⅢ兩種限制酶切割VP1基因和Ti質粒，可以防止VP1基因、Ti質粒的自身環化和反向連接。由于普通農桿菌中不含標記基因，只有導入重組質粒的農桿菌中含卡那霉素抗性基因，所以在培養基中添加卡那霉素可篩選出含有該目的基因表達載體的農桿菌。

（4）VP1基因應插入到農桿菌Ti質粒的T-DNA上，通過轉化作用進入番茄細胞并插入到染色體DNA上，使VP1基因能夠穩定存在并發揮作用。

（5）VP1蛋白質作為抗原注射到小鼠體內，可引起小鼠產生特異性免疫反應，產生相應的抗體，其結果可通過檢測豚鼠血液中產生的VP1蛋白的抗體數量來確定；為了使結果可信，應設置注射生理鹽水的空白對照組。