Question

【題目】禾谷鐮刀菌可侵染小麥等作物，使其產量和品質下降。研究者通過構建融合基因 Ve-FG 并轉化擬南芥，以期實現轉基因植物抗禾谷鐮刀菌的目的。

（1）利用 PCR 技術，將野生番茄的抗黃萎病基因 Ve 與禾谷鐮刀菌的識別基因 FG 進行重組，構建融合基因 Ve-FG（如圖 1）。

① 設計 3 對引物。其中引物 2 的一部分序列與 C 片段一部分序列互補，另一部分序列與_____片段一部分序列互補。

② 通過 PCR 分別克隆A、C、P 片段�？寺� A 片段應選用的引物是_____。

③ 以 A、C、P 片段為_____進行延伸，將 A、P、C 片段拼接，再以引物 1、4 進行 PCR，擴增融合基因 Ve-FG。

（2）用_____將 Ve-FG 與質粒連接，構建重組質粒（如圖 2，圖中潮霉素抗性基因只在植物細胞中表達）。將農桿菌與重組質�；旌�，一段時間后涂布到含有_____的平板培養基上進行篩選。用含重組質粒的農桿菌轉化擬南芥，幾周后收獲種子，種在含有潮霉素的培養基上，獲得轉基因擬南芥株系 1 和株系 2。

（3）分別提取株系 1 和 2、非轉基因擬南芥植株葉片中的 DNA 作為模板，PCR 擴增 Ve-FG 基因后進行電泳，結果如圖 3。

① 電泳時應以_____為陽性對照。

② 成功導入 Ve-FG 基因的是_____。

③ 株系 1 可抗潮霉素，但電泳結果無陽性條帶，原因可能是_____。

（4）為檢驗融合基因 Ve-FG 的功能，以導入 Ve-FG 基因的植株為實驗組，導入空白質粒的植株為對照組，分別接種_____。一段時間后觀察發現，與對照植株相比，實驗組整體長勢更旺盛，葉片萎蔫程度、葉片變黃程度也較輕，這表明_____。

Answer 1

【答案】P 1、3 模板 DNA連接酶 卡那霉素 融合基因 Ve-FG 株系 2 株系1中導入的是空白質粒，應空白質粒中也含有上述的兩種抗性基因 禾谷鐮刀菌 轉基因擬南芥中的Ve-FG基因在擬南芥細胞中成功表達。

【解析】

PCR一般要經歷三十多次循環，每次循環可分為變性、復性、延伸三步。在循環之前，常需要進行一次預變性，以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率。PCR過程為:變性，當溫度上升到90 ℃以上時，氫鍵斷裂，雙鏈DNA解旋為單鏈。復性，當溫度降低到50℃左右是，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合。延伸，溫度上升到72 ℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。

（1）① 設計 3 對引物。其中引物 2 的一部分序列與 C 片段一部分序列互補，另一部分序列與P片段一部分序列互補，才能實現圖示的連接。

② 通過 PCR 分別克隆A、C、P 片段。選用的引物1、3可完成A 片段的克隆。

③ 以 A、C、P 片段為模板進行延伸，將 A、P、C 片段拼接，再以引物 1、4 進行 PCR，擴增融合基因 Ve-FG。

（2）用DNA連接酶將 Ve-FG 與質粒連接，構建重組質粒（如圖 2）。將農桿菌與重組質粒混合，由于 重組質粒中含有抗卡那霉素的基因和潮霉素抗性基因，但是潮霉素抗性基因只在植物細胞中表達，因此，一段時間后將農桿菌涂布到含有卡那霉素的平板培養基上進行篩選，從而將經過轉化的農桿菌篩選出來。用含重組質粒的農桿菌轉化擬南芥，幾周后收獲種子，種在含有潮霉素的培養基上，從而將含有重組質粒的擬南芥株系 1 和株系 2篩選出來。

（3）分別提取株系 1 和 2、非轉基因擬南芥植株葉片中的 DNA 作為模板，PCR 擴增 Ve-FG 基因后進行電泳，結果如圖 3。

① 電泳時應以融合基因 Ve-FG為陽性對照。

② 成功導入 Ve-FG 基因的是株系2。

③ 株系 1 可抗潮霉素，但電泳結果無陽性條帶，原因可能是株系1導入的是空白質粒，從而不能急檢測到目的基因。

（4）為檢驗融合基因 Ve-FG 的功能，以導入 Ve-FG 基因的植株為實驗組，導入空白質粒的植株為對照組，分別接種禾谷鐮刀菌。一段時間后觀察發現，與對照植株相比，實驗組整體長勢更旺盛，葉片萎蔫程度、葉片變黃程度也較輕，這表明導入的Ve-FG基因在擬南芥細胞中成功表達。