Question

【題目】口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種動物傳染病,目前常用接種弱毒疫苗的方法預防。疫苗的主要成分是該病毒的一種結構蛋白VP1�？茖W家嘗試利用轉基因番茄來生產口蹄疫疫苗。請回答下列問題:

（1）如圖是VP1基因、農桿菌Ti質粒結構示意圖,若用以構建具有VP1基因的基因表達載體,還需要在質粒中插入______，該結構的作用是______。

（2）口蹄疫病毒的遺傳物質為RNA,則獲得可重組到質粒的VP1基因必須用到______酶。要獲得大量VP1基因,可利用PCR技術進行擴增，擴增時需要設計______種引物。PCR技術中所用的DNA聚合酶與生物體內的DNA聚合酶有何區別______。

（3）通常用BamHⅠ、HindⅢ兩種限制酶切割VP1基因和Ti質粒的目的是______;要篩選出含有該目的基因表達載體的農桿菌,首先需要在含______的培養基上進行。

（4）VP1基因應插入到農桿菌Ti質粒的T-DNA上,通過轉化作用進入番茄細胞并插入到______,使VP1基因能夠穩定存在并發揮作用。

（5）獲得表達VP1蛋白的番茄植株以后,要進行免疫效力的測定,具體方法是:將從轉基因番茄葉片中提取的VP1蛋白注射到一定數量的豚鼠體內,每半個月注射一次,三次注射后檢測豚鼠血液中產生的______數量,為了使結果可信,應設置空白對照組,注射______。

Answer 1

【答案】啟動子 RNA聚合酶識別、結合的部位，驅動基因轉錄 逆轉錄 2 耐高溫 防止VP1基因、Ti質粒的自身環化(和任意連接) 卡那霉素 染色體DNA VP1蛋白的抗體 等量生理鹽水

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）構建具有VP1基因的基因表達載體還需要在質粒中插入啟動子，啟動子是RNA聚合酶的識別、結合位點，能啟動轉錄過程。

（2）口蹄疫病毒的遺傳物質為RNA，可以RNA為模板逆轉錄獲得VPI基因；PCR技術可在體外大量擴增目的基因，該過程中需要設計2種引物分別與模板鏈結合，PCR擴增過程中需要耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈的延伸。

（3）用BamH I、HindIII兩種限制酶切割出的末端完全不同，這樣可以防止目的基因、運載體自身環化，也能防止目的基因和運載體反向連接，即可以保證目的基因和質粒的定向連接。由圖可知，標記基因是卡那霉素抗性基因，因此要篩選出含有該目的基因表達載體的番茄細胞，首先需要在含卡那霉素的培養基上進行。

（4）VP1基因應插入到農桿菌Ti質粒的T-DNA上，通過轉化作用進入番茄細胞并插入到染色體DNA，使VP1基因能夠穩定維持并發揮作用。

（5）獲得表達VP1蛋白的番茄植株以后，要進行免疫效力的測定，具體方法是：將從轉基因番茄葉片中提取的VP1蛋白質注射到一定數量的豚鼠體內，每半個月注射一次，三次注射后檢測豚鼠血液中產生的VP1蛋白的抗體數量，為了使結果可信，應設置空白對照組，注射VP1蛋白的抗體等量生理鹽水。