Question

【題目】現代基因編輯CRISP／Cas9技術可以對生物的DNA序列進行定點切割。將編碼Cas9酶和sgRNA的基因作為外源基因構建基因表達載體后，導入受體細胞，可將細胞內某個基因定向敲除，其作用機理如下圖所示。請回答問題。

（1）sgRNA與Cas9酶是一個功能復合體。如圖所示，sgRNA有引導作用，與A基因中部分序列堿基互補配對，Cas9酶在配對區域定點切割，導致A基因發生堿基對_________，基因喪失功能。sgRNA與Cas9酶的聯合作用類似于_________酶的作用。如果要獲得基因敲除動物個體，應以_________作為受體細胞，用_________法導入CRISP／Cas9基因表達載體。

（2）研究人員擔心基因編輯發生“脫靶效應”，導致其他非目標基因發生突變，我國科學家對此進行了檢測。在小鼠受精卵分裂為兩個細胞時，向其中一個細胞注入基因編輯工具，之后將此胚胎移植入母鼠子宮，待其發育到14.5天時，將胚胎取出，把胚胎的細胞全部分散開，分成基因編輯細胞后代和非基因編輯細胞后代兩個細胞群，分別提取DNA，測序、比對。結果發現CRISP／Cas9技術的脫靶率很低，而另一類單堿基突變系統的基因編輯技術脫靶率極高。

①用同一受精卵分裂形成的兩個細胞作為處理對象和對照，優點是________。

②利用二細胞胚胎分裂產生的子細胞DNA作為測序對象，而不是將實驗組細胞和對照組細胞DNA進行PCR擴增后測序，原因是____________________________________。

③為方便將基因編輯細胞后代和非基因編輯細胞后代分開，可在構建基因表達載體時_____________________________________________。

④將胚胎細胞分散開需要利用_________酶的作用。

⑤上述研究除了利用基因編輯技術之外，還利用了多項胚胎工程技術，請寫出其中兩項技術名稱__________________。

（3）基因編輯的“脫靶效應”可能對被編輯個體帶來什么不良影響?__________________

Answer 1

【答案】缺失 限制酶 受精卵 顯微注射 這兩個細胞的基因序列相同，避免因實驗組和對照組細胞原有的基因序列差異掩蓋“脫靶效應” PCR擴增會產生較多的復制錯誤，掩蓋“脫靶效應”； 利用某種熒光蛋白基因作為標記基因 胰蛋白酶 體外受精技術、胚胎培養技術、胚胎移植技術 如果脫靶效應發生在原癌基因，可能導致細胞癌變

【解析】

基因工程技術的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。
（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）sgRNA與Cas9酶是一個功能復合體。如圖所示，sgRNA有引導作用，與A基因中部分序列堿基互補配對，Cas9酶在配對區域定點切割，導致A基因發生堿基對 缺失，基因喪失功能。sgRNA與Cas9酶的聯合作用類似于限制酶的作用。如果要獲得基因敲除動物個體，應以受精卵作為受體細胞，用顯微注射法導入CRISP／Cas9基因表達載體。

（2）①用同一受精卵分裂形成的兩個細胞怍為處理對象和對照，優點是這兩個細胞的基因序列相同，避免因實驗組和對照組細胞原有的基因序列差異掩蓋“脫靶效應” 。

②利用二細胞胚胎分裂產生的子細胞DNA作為測序對象，而不是將實驗組細胞和對照組細胞DNA進行PCR擴增后測序，原因是PCR擴增會產生較多的復制錯誤，掩蓋“脫靶效應”。

③為方便將基因編輯細胞后代和非基因編輯細胞后代分開，可在構建基因表達載體時利用某種熒光蛋白基因作為標記基因。

④將胚胎細胞分散開需要利用胰蛋白酶的作用。

⑤上述研究除了利用基因編輯技術之外，還利用了多項胚胎工程技術，如體外受精技術、胚胎培養技術、胚胎移植技術。

（3）基因編輯的“脫靶效應”可能對被編輯個體帶來的不良影響是如果脫靶效應發生在原癌基因，可能導致細胞癌變。