Question

【題目】利用轉基因的工程菌生產藥用蛋白，近些年在我國制藥行業中異軍突起。圖1表示基因工程常用的一種質粒。

回答有關問題：

（1）SphⅠ和SacⅠ兩種限制酶識別并切割不同的DNA序列，將目的基因和質粒都通過SphⅠ和SacⅠ切割，可以避免_______________。拼接成重組質粒，需要加入_______________酶才能完成。

（2）各限制酶在該質粒上分別只有一處識別序列，有關質粒和重組質粒的限制酶酶切片段長度如下表所示。已知質粒被切除的片段長度為0.5kb，則與質粒結合的目的基因長度為_____

kb。質粒上ClaⅠ與PstⅠ區域之間的長度為2.4kb（圖1所示），結合圖2分析目的基因上ClaI、PstⅠ兩種限制酶的切割位點分別為___________（填“a和b”或“b和a”）。

	質粒	重組質粒
BglⅡ	6.0kb	7.1kb
ClaⅠ	6.0kb	2.3kb， 4.8kb
PstⅠ	6.0kb	1.5kb， 5.6kb

（3）在篩選導入重組質粒的受體菌時，培養基中加入適量的________________，使導入重組質粒和普通質粒的受體菌都能在該培養基上生長。為了進一步篩選，可以利用抗原-抗體雜交的方法，若出現______________，則該受體菌可以作為工程菌。

（4）若要對藥用蛋白的結構進行改造，可利用____________工程對目的基因進行修飾。

Answer 1

【答案】目的基因和切割后質粒的自身環化 DNA連接 1.6 a和b 氨芐青霉素 雜交帶（抗原-抗體復合物） 蛋白質（第二代基因）

【解析】

基因工程的工具酶有限制酶和DNA連接酶，一般用同種限制酶切割質粒和目的基因，但容易造成自身環化現象。

（1）目的基因通過SphⅠ和SacⅠ切割產生的末端不同，可避免自身環化，質粒通過SphⅠ和SacⅠ切割，可避免切割后的質粒重新結合而環化；目的基因和質粒結合，需要DNA連接酶連接磷酸二酯鍵將缺口連接起來。

（2）根據表格信息，質粒為6.0kb，減去被切除的長度為0.5kb的片段，則剩余的為5.5kb，而重組質粒為7.1kb，說明插入的目的基因長度為7.1-5.5=1.6(kb)；質粒上含抗四環素基因的ClaⅠ與PstⅠ區域長度為2.4kb，減去被切取的片段長度為0.5kb后為1.9kb，插入的目的基因長度為1.6kb，所以重組質粒上含抗四環素基因的ClaⅠ與PstⅠ區域長度為1.9+1.6=3.5(kb)，又根據表格信息，通過ClaⅠ切割重組質粒，產生了2.3kb片段，通過PstⅠ切割重組質粒，產生了1.5kb片段。設PstⅠ切割位點為a，ClaⅠ切割位點為b，則會出現圖3中所示結果，而2.3+1.5=3.8，3.8﹥3.6，說明a為ClaI切割位點、b為PstⅠ切割位點，反之則不成立。

（3）重組質粒的抗四環素基因已經由于目的基因的插入而破壞，但氨芐青霉素基因完整，培養基中若加入適量的氨芐青霉素，含普通質粒和重組質粒的受體菌都能存活，而沒有導入質粒的細菌會死亡而淘汰；若受體菌成功導入重組質粒，并且目的基因正常表達，則可以產生所需的藥用蛋白，通過抗原-抗體雜交的方法，若出現雜交帶，則該受體菌可以作為工程菌；通過蛋白質工程對目的基因進行修飾，從而實現對已有的藥用蛋白進行改造。