Question

【題目】hNaDC3（人鈉/二羧酸協同轉運蛋白-3）主要分布于腎臟等重要器官，它具有促進人腎小管上皮細胞能量代謝和轉運等功能�？蒲腥藛T利用基因工程技術構建綠色熒光蛋白與hNaDC3融合基因，并在腎小管上皮細胞中表達，以動態觀察hNaDC3在腎小管上皮細胞中的定位情況，為進一步研究hNaDC3的生理功能奠定基礎。研究主要過程如圖（實驗中使用的限制酶SacⅠ的識別序列是GAGCT↓C，限制酶SacⅡ識別序列是CCGC↓GG）。請分析回答：

（1）與PCR相比，過程①需要的特有的酶是_______，應從人體__________（器官）的組織細胞中獲得模板RNA。

（2）DNA分子被SacⅠ切割后，形成的黏性末端是______。過程②選用SacⅠ、SacⅡ分別切割hNaDC3基因和質粒載體，可實現目的基因定向插入并正常表達的原因是_________。

（3）過程③可獲得多種重組DNA，可依據不同DNA分子的大小，運用________（技術）分離、篩選重組表達載體。過程④將重組表達載體導入豬腎小管上皮細胞最常用的方法是____________。

（4）顯微觀察導入“綠色熒光蛋白-hNaDC3融合基因”的豬腎小管上皮細胞后發現：轉染后第1天綠色熒光混合分布于細胞質和細胞膜，核中未見綠色熒光；到第5天綠色熒光清晰聚集于細胞膜，細胞質和細胞核中未見綠色熒光。根據這一觀察結果還不能得出“hNaDC3是在細胞質中生成后，在細胞膜上發揮作用”的結論，需要設置對照實驗以排除綠色熒光蛋白本身的定位，對照實驗的設計思路是___________。

（5）研究人員以較高濃度的葡萄糖溶液培養導入融合基因的豬腎小管上皮細胞，一段時間后發現，轉染細胞的細胞膜上綠色熒光明顯增強。這一實驗結果可以說明______。

Answer 1

【答案】逆轉錄酶 腎臟 —AGCT 兩種限制酶切割產生的黏性末端不同 （凝膠）電泳 顯微注射法 將GFP基因表達載體直接導入豬腎小管上皮細胞，然后觀察綠色熒光在細胞中的分布情況 較高濃度葡萄糖能增強腎小管上皮細胞中hNaDC3基因的表達

【解析】

對題圖進行分析可知，過程①以RNA為模板，通過反轉錄作用合成目的基因；過程②表示構建hNaDC3基因表達載體；過程③表示構建綠色熒光蛋白-hNaDC3融合基因的表達載體；④表示將目的基因導入受體細胞；⑤表示目的基因的檢測和鑒定。

（1）過程①以RNA為模板，通過反轉錄作用合成目的基因。與PCR相比，過程①需要的特有的酶是逆轉錄酶。由于基因的選擇性表達，所以只能從人體腎臟的組織細胞中獲得模板RNA。

（2）根據題意可知，“限制酶SacⅠ的識別序列是GAGCT↓C”，因此DNA分子被SacⅠ切割后，形成的黏性末端是—AGCT。過程②選用SacⅠ、SacⅡ分別切割hNaDC3基因和質粒載體，兩種限制酶切割產生的黏性末端不同，因此可實現目的基因定向插入并正常表達。

（3）過程③可獲得多種重組DNA，可依據不同DNA分子的大小，運用（凝膠）電泳分離、篩選重組表達載體。將重組表達載體導入動物細胞最常用的方法是顯微注射法。

（4）根據題意可知，實驗探究目的為“hNaDC3是在細胞質中生成后，在細胞膜上發揮作用”。需要設置對照實驗排除綠色熒光蛋白本身的定位，即將GFP基因表達載體直接導入豬腎小管上皮細胞，然后觀察綠色熒光在細胞中的分布情況。

（5）用較高濃度的葡萄糖溶液培養導入融合基因的豬腎小管上皮細胞，一段時間后發現，轉染細胞的細胞膜上綠色熒光明顯增強，說明較高濃度葡萄糖能增強腎小管上皮細胞中hNaDC3基因的表達。