Question

【題目】雞干擾素是一種具有高效和廣譜抗病毒作用的細胞因子，廣泛用于動物領域的抗病毒治療�？蒲腥藛T將雞干擾素基因作為目的基因，構建基因表達載體，通過農桿菌介導法導入煙草，以獲得抗病毒煙草�；卮饐栴}：

(1)目的基因合成后可在Taq酶的作用下通過PCR技術大量擴增，該技術的原理是________________________。利用PCR技術擴增干擾素基因時，需要加入兩種引物，原因是_____________________________________。

(2)基因表達載體中應有RNA聚合酶識別和結合的部位，該部位稱為_________________。將基因表達載體導入農桿菌常用的方法是___________________________________。

(3)該實驗中，將農桿菌轉入煙草細胞的原生質體，原生質體再生出細胞壁。請從理論角度提出實驗室檢測原生質體是否再生出細胞壁的一種方法：________________________。

(4)科研人員提取煙草愈傷組織細胞的RNA后，先通過__________獲得DNA，再進行PCR擴增。若最終未能檢測出干擾素基因，可能原因是____________________；若轉基因煙草植株對病毒的侵染表現出一定的抗性，但抗性較低，可能原因是__________________。

Answer 1

【答案】DNA的熱變性（或DNA雙鏈復制） DNA兩條鏈反向平行，DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時擴增 啟動子 感受態細胞法（或Ca2+轉化法） 將細胞置于高滲溶液中，用顯微鏡觀察細胞是否發生質壁分離（或將細胞置于清水中，用顯微鏡觀察細胞是否脹破） 逆轉錄 雞干擾素基因未能導入煙草愈傷組織細胞（或導入煙草愈傷組織細胞的雞干擾素基因未能轉錄） 轉基因煙草體內干擾素的合成量較低（或合成的干擾素生物活性低）

【解析】

1、基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

2、PCR技術擴增目的基因：①原理：DNA雙鏈復制；②過程：第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈；第二步：冷卻到55～60℃，引物結合到互補DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成。

（1）利用PCR技術擴增干擾素基因時，依據的原理是DNA雙鏈復制的原理，設計引物序列的主要依據是干擾素基因兩條鏈兩端的部分核苷酸序列，由于DNA兩條鏈反向平行，而DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA子鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時擴增。

（2）基因表達載體必需具備的成分有目的基因、標記基因、啟動子、終止子和復制原點，其中啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，將基因表達載體導入農桿菌（微生物）時，常用Ca2+處理，使其處于感受態，因此將基因表達載體導入農桿菌的方法是Ca2+轉化法。

（3）根據題意，該實驗中將農桿菌轉入煙草細胞的原生質體后，需再生細胞壁，實驗室檢測原生質體是否再生出細胞壁，可以將細胞置于高滲溶液中，觀察是否發生質壁分離，如果發生質壁分離說明新的細胞壁已經形成。

（4）提取的愈傷組織細胞的RNA通過逆轉錄過程得到DNA；最終未能檢測出干擾素基因，可能是因為雞干擾素基因未能導入煙草愈傷組織細胞或導入煙草愈傷組織細胞的雞干擾素基因未能轉錄。若轉基因煙草植株對病毒的侵染表現出一定的抗性，但抗性較低，說明轉基因煙草體內干擾素的合成量較低或者合成的干擾素生物活性低。