Question

【題目】凝乳酶是奶酪生產中的關鍵性酶，直接利用動、植物生產凝乳酶受多種因素限制，培育高酶活力凝乳酶微生物菌種是目前最有前途的發展方向。用紫外線照射芽孢桿菌，分離、培養，并檢測各菌株所產生的凝乳酶活力，操作過程如圖所示。請分析回答：

（1）圖所示紫外線照射的原理是________，接種用的平板培養基________（是、不是）選擇培養基。

（2）在一定溫度下（35℃），一定時間內（通常為40分鐘），凝固1mL10％脫脂奶粉的酶量為一個酶活力單位（U），凝乳酶活力檢測結果如圖2所示。

①據圖所示，酶催化能力最強的是________組。

②A2、A5組酶活力單位與A0組芽孢桿菌相同，兩位同學對此做出了推測。

同學甲：A2、A5組芽孢桿菌未發生基因突變，因為基因突變具有________的特點。

同學乙：A2、A5組芽孢桿菌發生基因突變，但凝乳酶蛋白未改變，其依據的理由是________________。為了驗證上述2位同學的假設，可采用________________技術檢測凝乳酶基因是否發生了突變。

（3）從牛胃液中分離到的凝乳酶以催化能力強而被廣泛應用，研究人員運用基因工程技術，將編碼該酶的基因轉移到了微生物細胞中。

①從牛胃細胞中提取________________，再反轉錄形成cDNA。以此cDNA為模板PCR擴增目的基因，有時需要在引物的起始端設計________（限制酶、DNA連接酶、RNA聚合酶）識別序列，以便構建重組DNA分子。

②構建重組DNA分子（如圖所示）最好選用________________限制酶（填酶的名稱），理由是________________。

③工業化生產過程中，最初多采用重組大腸桿菌或芽孢桿菌生產凝乳酶，現多采用重組毛霉生產，毛霉作為受體細胞的優勢是___________________________________________________________________。

④研究發現，如果將該凝乳酶20位和24位氨基酸改變為半胱氨酸，其催化能力將提高2倍。通過蛋白質工程生產高效凝乳酶，所需步驟依次有________。

a．蛋白質的結構設計

b．蛋白質的結構和功能分析

c．蛋白質結構的定向改造

d．凝乳酶基因的定向改造

e．將改造后的凝乳酶基因導入受體細胞

f．將定向改造的凝乳酶導入受體細胞

Answer 1

【答案】基因突變 不是 A6 低頻率性（稀有性） 一種氨基酸可能對應多種密碼子（基因突變發生在非編碼區或密碼子有簡并性） DNA分子雜交（DNA測序） mRNA 限制酶 BamHⅠ和PstⅠ 提高重組DNA分子的比例（防止自身的黏性末端連接，防止目的基因與載體反向連接） 含有內質網和高爾基體，可對蛋白質進行加工和修飾 b、a、d、e

【解析】

本題結合圖示主要考查基因工程的原理及技術、基因工程的應用、蛋白質工程等。據圖第一個圖所示的b過程為菌落的稀釋，培養基中含有多種酶活力不同的突變芽孢桿菌；第二個圖中，凝固1mL10%脫脂奶粉的酶量最少的是6組；分析第三個圖可知，質粒和外源DNA中共同含有且不會破壞目的基因的限制酶是BamHI和PstI。

（1）圖所示紫外線照射使細胞中的基因發生改變，其原理是基因突變；接種用的平板培養基為不管突變與否的芽孢桿菌提供營養物質的，不用于篩選，故不是選擇培養基。

（2）①據圖2所示，凝固1mL10%脫脂奶粉的酶量最少的是A6組，故酶催化能力最強的是A6組。②同學甲：基因突變有低頻性的特點，故很可能使A2、A5組的細菌均未發生基因突變。同學乙：如果A2、A5組芽孢桿菌發生基因突變，但凝乳酶蛋白未改變，這可能是因為一種氨基酸可能對應多種密碼子，隨基因發生突變，但不會改變翻譯出來的氨基酸；也可能是因為發生基因突變的區段為非編碼區。為了驗證上述2位同學的假設，可采用DNA分子雜交技術檢測凝乳酶基因是否發生了突變。

（3）①牛胃細胞中含有能翻譯出凝乳酶的mRNA，可逆轉錄得到cDNA．構建重組DNA分子時，需用同種限制性內切酶處理目的基因和載體，故需要在引物的5’端設計限制酶識別序列，以便構建重組DNA分子。
②由圖3可知，質粒和外源DNA中共同含有且不會破壞目的基因的限制酶是BamHI和PstI，因此構建重組DNA分子最好選用BamHI和PstI限制酶，這樣可以防止自身的黏性末端連接，防止目的基因與載體反向連接。
③毛霉較重組大腸桿菌或芽孢桿菌作為受體細胞的優勢是毛霉為真核微生物，含有內質網和高爾基體可對蛋白進行加工和修飾。

④通過分析想要的蛋白質的功能，預測蛋白質應有的結構，然后根據蛋白質的結構逆向推測控制該蛋白質合成的基因的堿基組成及排列順序．最后就是將改造后的目的基因導入受體細胞，從而轉錄翻譯得出目的蛋白，故順序為b、a、d、e。