Question

10．GDNF是一種神經營養因子．對損傷的神經細胞具有營養和保護作用．研究人員構建了含GDNF基因的表達載體（如圖1所示），并導入到大鼠神經干細胞中，用于干細胞基因治療的研究．請回答：

（1）在分離和培養大鼠神經干細胞的過程中，使用胰蛋白酶的目的是使細胞分散開．
（2）構建含GDNF基因的表達載體時，需選擇圖1中的限制酶XhoⅠ進行酶切．
（3）經酶切后的載體和GDNF基因進行連接，連接產物經篩選得到的載體主要有三種：單個載體自連、GDNF基因與載體正向連接、GDNF基因與載體反向連接（如圖1所示）．為鑒定這3種連接方式，選擇HpaI酶和BamHI酶對篩選的載體進行雙酶切，并對酶切后的DNA片段進行電泳分析，結果如圖2所示．圖中第②泳道顯示所鑒定的1載體是正向連接的．
（4）將正向連接的表達載體導入神經干細胞后，為了檢測GDNF基因是否成功表達，可用相應的與提取的蛋白質雜交．當培養的神經干細胞達到一定的密度時，需進行培養以得到更多數量的傳代細胞，用于神經干細胞移植治療實驗．

Answer 1

分析 1、基因工程技術的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成．
（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等．
（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法．
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．
2、動物細胞培養的過程：取動物組織塊→剪碎組織→用胰蛋白酶處理分散成單個細胞→制成細胞懸液→轉入培養液中（原代培養）→放入二氧化碳培養箱培養→貼滿瓶壁的細胞用酶分散為單個細胞，制成細胞懸液→轉入培養液（傳代培養）→放入二氧化碳培養箱培養．

解答 解：（1）動物細胞培養時，可用胰蛋白酶或膠原蛋白酶作用，使細胞分散開．
（2）質粒上有XhoⅠ識別位點，而且在啟動子之后，所以選用XhoⅠ限制酶進行酶切．
（3）泳道①僅有一種條帶，屬于載體自連；泳道②有兩種條帶，且長度分別與質粒和GDNF基因長度相同，為正向連接；泳道③有兩種條帶，長度與BamHⅠ酶切后結果相同，為反向連接．
（4）檢測基因是否表達采用抗原抗體雜交法．培養動物細胞采用動物細胞培養法，當細胞密度達到一定程度，需要進行分瓶，進行傳代培養．
故答案為：
（1）使細胞分散開
（2）XhoⅠ
（3）②
（4）抗體   傳代

點評 本題考查基因工程、動物細胞培養的相關知識，要求考生識記基因工程的原理、操作工具及操作步驟等，掌握各步驟中的相關細節，能結合所學的知識準確判斷各選項．