Question

【題目】Ⅱ型干擾素是效應T細胞分泌的一種淋巴因子，可用于治療病毒感染和癌癥�？茖W家將Ⅱ型干擾素基因與大腸桿菌的DNA分子進行了重組，成功地在大腸桿菌中得以表達。

（1）若用PCR技術擴增Ⅱ型干擾素基因，其前提條件是有一段______，以便根據這一序列合成引物。PCR過程需要經過多次循環，每一個循環包括：加熱變形→冷卻復性→加熱延伸，其中冷卻復性的目的是______，加熱延伸過程中發生最主要的過程是______。

（2）已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識別序列和切點—↓GATC—，Ⅱ型干擾素基因結構如圖中所示。

①在構建基因表達載體的過程中，用限制酶______切割質粒，用限制酶______切割目的基因。

②將得到的大腸桿菌涂布在一個含有氨芐青霉素的培養基上，得到如圖a所示的結果（圓點表示菌落），該結果說明能夠生長的大腸桿菌中已導入了______。將滅菌絨布按到培養基a上，使絨布表面沾上菌落，然后將絨布按到含四環素的培養基上培養，得到如圖b所示的結果（圓圈表示與圖a培養基上對照無菌落的位置）。與圖b圓圈相對應的圖a中的菌落表現型是______，這些大腸桿菌中導入了______。

Answer 1

【答案】已知核苷酸序列的目的基因 便于引物與互補的DNA鏈的結合 在7075℃時，熱穩定的DNA聚合酶把單個脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵連接到引物上，如此逐漸延伸形成互補鏈 Ⅰ Ⅱ 普通質�；蛑亟M質粒 抗氨芐青霉素但不抗四環素 重組質粒

【解析】

1.獲得目的基因的方法：①從基因文庫中獲取②利用PCR技術擴增③人工合成（化學合成）。PCR技術的原理是DNA雙鏈復制。利用PCR技術擴增目的基因的前提條件是：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據這一序列合成引物。利用PCR擴增目的基因的過程由高溫變性(9095℃)、低溫復性(5560℃)、適溫延伸(7075℃)三個步驟構成一個循環，在擴增過程中離不開Taq酶(熱穩定性DNA聚合酶)的催化。

2.將得到的大腸桿菌B涂布在一個含有氨芐青霉素的培養基上，因質粒上有抗氨芐青霉素基因，且重組質粒上的抗氨芐青霉素基因，也沒有被破壞，所以如果大腸桿菌B能夠生長，說明已導入了含抗氨芐青霉素基因的普通質�；蛑亟M質粒，反之則沒有導入。

3.分析題圖：圖示表示利用基因工程培育工程菌的過程，圖中②表示基因表達載體的構建過程，該過程需要限制酶和DNA連接酶；③表示將目的基因導入大腸桿菌的過程，轉化后的大腸桿菌經過檢測和篩選獲得工程菌。

（1）根據以上分析可知，用PCR技術擴增Ⅱ型干擾素基因，其前提條件是有一段已知核苷酸序列的目的基因，以便根據這一序列合成引物。PCR過程冷卻復性(5560℃)的目的是便于引物與互補的DNA鏈的結合，加熱延伸過程中發生最主要的過程是在7075℃時，熱穩定的DNA聚合酶把單個脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵連接到引物上，如此逐漸延伸形成互補鏈，進而使目的基因加倍。

（2）①在構建基因表達載體時，需用限制酶對目的基因和質粒進行切割以形成相同的黏性末端。質粒如果用限制酶Ⅱ來切割的話，將會在質粒在出現兩個切口且抗生素抗性基因全被破壞，故質粒只能用限制酶Ⅰ切割（破壞四環素抗性而保留氨芐青霉素抗性，即將來形成的重組質粒能在含氨芐青霉素的培養基中生存，而在含四環素的培養基中不能生存）；目的基因兩端都出現黏性末端時才能和質粒發生重組，故目的基因只有用限制酶Ⅱ切割時，才會在兩端都出現黏性末端。

②因本題質粒上有2個標記基因，但抗四環素基因被插入的基因破壞掉，因此剩下的是抗氨芐青霉素抗性基因，如果在含氨芐青霉素的培養基上能生長，說明已經導入了重組質�；蚱胀ㄙ|粒，因為普通質粒和重組質粒都含有抗氨芐青霉素的基因。與圖2中b空圈相對應的圖2的a中的菌落表現型是抗氨芐青霉素但不抗四環素，說明這些細菌中導入了重組質粒。