Question

6．目前所用的質粒載體主要是以天然細菌質粒的各種元件為基礎重新組建的人工質粒，pBR322質粒是較早構建的質粒載體，其主要結構如圖所示．
（1）構建人工質粒時要有抗性基因，以便于篩選（鑒別目的基因是否導入受體細胞）．
（2）pBR322分子中有單個EcoR I限制酶作用位點，EcoR 1只能識別序列一GAATTC一，并只能在G與A之間切割．若在某目的基因的兩側各有1個EcoR I的切點，請畫出目的基因兩側被限制酶EcoR I切割后所形成的黏性末端．
（3）pBR322分子中另有單個的BamHI限制酶作用位點，現將經BamHI處理后的質粒與用另一種限制酶BgIⅡ處理得到的目的基因，通過DNA連接酶作用恢復磷酸二酯鍵 鍵，成功的獲得了重組質粒．
（4）為了檢測上述重組質粒是否導入原本無ampR和tetR的大腸桿菌，將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養基上培養，得到如圖二的菌落．再將滅菌絨布按到培養基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到含四環素的培養基上培養，得到如圖三的結果（空圈表示與圖二對照無菌落的位置）．與圖三空圈相對應的圖二中的菌落表現型是能抗氨芐青霉素，但不能抗四環素，圖三結果顯示，多數大腸桿菌導入的是pBR322質粒．

Answer 1

分析 分析題圖：菌落能在含有氨芐青霉素的培養基生存，說明了菌落含有抗氨芐青霉素基因；將沾上菌落絨布按到含四環素的培養基上培養，仍能生長，說明了菌落也含有抗四環素基因，不能生長的則不含抗四環素基因．

解答 解：（1）質粒上的抗性基因可作標記基因，便于鑒定受體細胞中是否導入目的基因．
（2）在目的基因的兩側各有1個EcoRⅠ的切點，即目的基因兩側有-GAATTC-，目的基因兩側被限制酶EcoRI切割后所形成的黏性末端為．
（3）DNA連接酶能連接磷酸二酯鍵．
（4）圖二中的菌落能抗氨芐青霉素，將滅菌絨布按到圖二中培養基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布按到圖三含四環素的培養基上培養，仍能生長的也能抗四環素，空圈為不能抗四環素的（只能抗氨芐青霉素）．圖三結果顯示，多數大腸桿菌既能抗氨芐青霉素，又能抗四環素，說明導入的是pBR322質粒，而不是重組質粒（重組質粒的四環素抗性基因被切斷，不能表達，因此含重組質粒的大腸桿菌抗氨芐青霉素）．
故答案為：
（1）篩選（鑒別目的基因是否導入受體細胞）
（2）

（3）磷酸二酯鍵
（4）能抗氨芐青霉素，但不能抗四環素     pBR322質粒

點評 本題結合圖解，考查基因工程的相關知識，要求考生識記基因工程的原理及操作步驟，掌握基因工程各操作步驟中需要注意的細節，能結合圖中信息準確答題，屬于考綱識記和理解層次的考查．