Question

【題目】玉米是我國重要的糧食作物和飼料來源，低溫會影響玉米的產量和品質。研究者將從微生物中獲得的CSP（冷激蛋白）基因與玉米基因的ubi啟動子相連后構建基因表達載體，并將其導入玉米細胞中，獲得了具有低溫耐受性的玉米植株，過程如圖1所示。

（1）研究者提取玉米的DNA，利用PCR技術將ubi啟動子擴增出來。該過程需設計合適的引物，引物設計時需已知___________，為便于進行后續操作還在引物中添加了限制酶的識別序列。在反應體系內，至少需___________次擴增才能獲得所需的ubi啟動子。

（2）圖1所示的流程圖中，過程①需___________的催化，獲得的ubi-CSP基因在構建基因表達載體時，在Ti質粒上的插部位為___________。過程②需要用CaCl2溶液處理農桿菌，其目的是___________。過程③完成后，將玉米愈傷組織轉入含___________的培養基中進行篩選，篩選后的愈傷組織再經培育獲得轉基因玉米。

（3）研究者分別提取了野生型玉米及5株轉基因玉米的染色體DNA，用限制酶處理后進行電泳。電泳后的DNA與基因探針進行雜交，得到圖2所示放射性檢測結果，該基因探針應為___________片段，實驗結果表明___________。

（4）在個體水平上對轉玉米植株進行___________實驗，可檢測CSP基因是否已在玉米中表達。

Answer 1

【答案】ubi兩端的一段序列 3 限制酶和DNA連接酶 T-DNA內部（且不破壞hpt） 獲得感受態細胞（或:使農桿菌處于易于吸收外源DNA的狀態） 潮霉素 含放射性同位素標記的CSP基因 除植株3外，其他4株轉基因玉米中CSP基因均已整合到玉米染色體基因組中 低溫耐受性

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成；

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等；

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態細胞法；

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）在利用PCR技術進行擴增時，需要事先設計引物，這里需要根據ubi啟動子設計合適的引物，因此需已知ubi兩端的一段序列，為便于進行后續操作還在引物中添加了限制酶的識別序列。在反應體系內，至少需3次才能獲得引物之間的核苷酸序列，即至少需3次擴增才能獲得所需的ubi啟動子。

（2）圖1中，過程①為載體和目的基因相連的過程，因此需限制酶和DNA連接酶的催化從而實現連接，在獲得ubi-CSP基因構表達載體時，需要將ubi-CSP基因插入T-DNA內部（且不破壞hpt），這樣能保證T-DNA轉移時攜帶目的基因與玉米的染色體DNA連接。過程②為導入受體細胞的過程，為了提高導入的成功率，通常用CaCl2溶液處理農桿菌，使其成為感受態細胞，因為處于感受態的農桿菌易于吸收外源DNA，過程③完成后，將玉米愈傷組織轉入含潮霉素的培養基中進行篩選，篩選后的愈傷組織再經脫分化過程長成幼苗，從而獲得了轉基因玉米植株

（3）圖2所示放射性檢測結果，因此這里的基因探針為含放射性同位素標記的CSP基因片段，實驗結果顯示在第1、2、4、5株玉米中檢測出目的基因的放射性，據此可知除植株3外，其他4株轉基因玉米中CSP基因均已整合到玉米染色體基因組中。

（4）在個體水平上，可以通過對轉玉米植株進行低溫耐受性實驗，進而檢測CSP基因是否在玉米中成功表達。